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Contrôle microbiologique

Détection d’E. coli, pas si simple de s’y retrouver !

Pourquoi recherche-t-on E. coli?

Escherichia coli (E. coli) est une bactérie intestinale Gram négative qui réside dans le tube digestif de l’Homme et des animaux à sang chaud. Composée de plus de 150 sérogroupes différents, la grande majorité des E. coli sont inoffensives. Cependant, quelques-unes sont pathogènes pour l’Homme (Source : Institut Pasteur). C’est le cas des souches dites entérohémorragiques (ECEH). Ces dernières provoquent des diarrhées sanglantes et produisent une puissante toxine à l’origine du syndrome hémolytique et urémique (SHU).

A l’exception de ces quelques souches pathogènes, E. coli fait partie de la flore commensale de l’Homme. Elle peut même représenter jusqu’à 80% de la biomasse intestinale. En revanche, E. coli n’est pas une souche naturelle de l’environnement. La retrouver dans un échantillon d’eau signifie que celui-ci a été en contact avec des matières fécales et est donc très potentiellement contaminé par d’autres micro-organismes pathogènes pour l’homme. E. coli a donc tout logiquement été utilisée comme indicateur de contamination fécale dans l’eau potable. Ce paramètre est une limite de qualité définie dans la Directive Européenne 2020/2184. Elle doit être égale à 0 UFC dans 100 ml. A partir de 1 colonie sur une boîte de pétri, l’échantillon est positif.

La Loi de Poisson

Cette loi de probabilité s’applique aux événements rares et est fréquemment utilisée pour les contrôles de qualité. Elle est parfaitement adaptée au dénombrement des E. coli dans l’eau potable qui demande la détection de 1 UFC dans 100 ml. La Loi de Poisson permet entre autres d’expliquer des résultats négatifs au milieu de résultats positifs pour un même échantillon.

Exemple :
On contamine un échantillon d’eau de 10 litres avec 100 UFC d’E. coli (soit 1 UFC/100ml). En réalisant 100 analyses de 100 ml d’eau, d’après la Loi de Poisson, nous obtiendrons théoriquement :

  • 36% d’échantillons négatifs, 
  • 36% d’échantillons contenant 1 UFC/100 ml, 
  • 18% d’échantillons avec 2 UFC/100 ml,
  • 10% d’échantillons avec 3 UFC/100 ml ou plus. 

Ainsi, malgré un échantillon d’eau positif, il est très probable d’obtenir un résultat négatif. Cette distribution asymétrique est particulièrement marquée pour un nombre d’événement faible (< 5). Au-dessus de 5 événements, la distribution se rapproche de la loi normale.
Cette distribution asymétrique s’explique entre autres par la variabilité du prélèvement et la répartition non homogène des microorganismes dans l’eau.

Tout cela rend difficile la quantification de moins de 5 événements, et peut expliquer l’alternance de résultats positifs/négatifs sur un même échantillon.

Pourquoi utiliser un indicateur de contamination fécale ?

L’eau véhicule de très nombreux pathogènes pour l’eau. De ce fait, il est impossible de tous les rechercher à chaque analyse. La présence de ces pathogènes est très souvent associée à la contamination par des matières fécales. C’est pour cette raison qu’il a été décidé de travailler sur des indicateurs. La bactérie E. coli, bien connue, se multiplie rapidement ce qui la rend plus simple à identifier par rapport à d’autres indicateurs ou microorganismes pathogènes spécifiques (Santé Canada, 2012 ; WHO, 2011).

 

Quelles normes pour le dénombrement des coliformes et des E. coli dans l’eau potable ?

La recherche et le dénombrement des bactéries Escherichia coli (E. coli) et des bactéries coliformes dans les eaux destinées à la consommation humaine (EDCH) doit se faire selon la norme ISO 9308-1. Jusqu’en 2014, la recherche des E. coli et des bactéries coliformes était basée sur la norme éditée en 2000 comprenant une filtration des eaux à analyser sur membrane, suivie d’une mise en culture sur une gélose de différenciation lactosée TTC (Chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium). La confirmation de la présence d’E. coli s’effectue via sa capacité à produire de l’indole après une phase d’incubation de 24h à 44°C dans un bouillon tryptophane. La réaction de l’indole avec le réactif de Kovac donne une coloration rouge aux colonies.

En 2014, la révision de l’ISO 9308-1 propose une modification importante du principe analytique. En effet, dans cette nouvelle version, les bactéries coliformes et les E. coli sont caractérisées par la présence d’activités enzymatiques caractéristiques. Il s’agit des activités β-D-galactosidase et β-D-glucuronidase respectivement, avec une mise en évidence sur milieu gélosé CCA (Chromogenic Coliform Agar). Les bactéries sont identifiées grâce à l’apparition d’une coloration de la colonie : coloration rose à saumon pour les coliformes et coloration bleue à violette pour les E. coli. Attention, ces couleurs caractéristiques peuvent changer d’un fabricant à l’autre.

« Les deux méthodes ne sont pas équivalentes pour le dénombrement des bactéries E. coli dans les eaux d’alimentation. »*

Alors que la norme ISO 9308-1 (2014) devait totalement remplacer la version de 2000, un rapport de l’ANSES (2018), mandaté par l’État, fait état de plusieurs déviations entre les deux approches. Leurs travaux montrent un risque de déclarer injustement des résultats non conformes ou de sous-estimer un risque sanitaire avec l’ISO 9308-1 (2014). L’ANSES demande donc de faire évoluer le protocole décrit dans l’ISO 9308-1 (2014) de manière à fiabiliser les dénombrements. Par ailleurs, certaines souches d’E. coli telles qu’Escherichia coli O157 (ex : O157:H7 entérohémorragique) sont négatives à la β-D-glucuronidase. Étant par contre positives à la β-D-galactosidase, elles sont considérées comme des bactéries coliformes sur les géloses CCA.

Dès lors, la France fait coexister l’existence des deux versions de la norme. Il est possible de faire ses analyses selon la version 2014 sous accréditation COFRAC, mais l’ARS demande que les analyses réglementaires du contrôle sanitaire de l’EDCH soient réalisées selon la version de 2000.

*Rapport d’appui scientifique et technique, Septembre 2018, ANSES

Ce que l’ATP-métrie peut vous apporter

Un problème demeure quant au dénombrement des bactéries E. coli et des coliformes : le temps d’obtention des résultats. En effet, en accumulant le transport des échantillons, le temps d’incubation et le délai de traitement des résultats, il est très fréquent d’avoir le résultat d’analyse par un laboratoire accrédité 48h à 72h après le prélèvement. Or, les exploitants ont besoin d’outils rapides permettant de contrôler in-situ la qualité microbiologique de l’eau afin de réagir en temps réel face à un risque de contamination.  Des méthodes alternatives telles que le Colilert d’Idexx existent. Réalisable par l’exploitant, quantitatif, et sans besoin de confirmation des colonies, il est plus rapide que la méthode traditionnelle. Cependant, elle nécessite quand même 18h d’incubation et un petit laboratoire.

Face à ce besoin de réactivité et de méthode de terrain, l’ATP-métrie quantitative DENDRIDIAG prend tout son sens. Aisément manu-portable et très simple d’utilisation, l’ATP-métrie donne le résultat en moins de 2 minutes au pied de la canalisation.

« Une méthode pour décider et agir en temps réel sur le terrain »

Les modes de désinfection utilisés étant non sélectifs, ils éliminent l’ensemble de la biomasse. L’ATPmétrie quantitative mesure la biomasse vivante totale et valide donc l’efficacité des traitements. Cet outil diagnostic permet à l’opérateur de statuer immédiatement sur l’efficacité d’une désinfection ou la nécessité d’une action corrective

Une webapp disponible gratuitement sur smartphone donne une interprétation claire et qualifiée du résultat. En plus de la mesure microbiologique, elle intègre les paramètres physico-chimiques et donne ainsi une analyse combinatoire très robuste. Lorsque le résultat apparaît conforme cela signifie que le traitement est efficace et que le risque d’avoir une analyse E. coli ou entéro positive est minime.

Ainsi, cet outil d’aide à la décision sécurise et rassure l’exploitant avant une analyse réglementaire tout en lui évitant des retours de chantier coûteux. Cette approche est aussi particulièrement efficace lors d’une gestion de crise. 
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Pourquoi, quand et comment rechercher les coliphages somatiques et les bactériophages ARN F-spécifiques ?

Indicateurs viraux, paramètres désormais intégrés dans la réglementation

La réglementation européenne a introduit le suivi des coliphages pour contrôler la qualité virologique de l’eau potable et de l’eau issue des procédés de REUT.

Pour le contrôle de l’eau potable, seule la recherche des coliphages somatiques est demandée par la Directive UE 2020/2184. C’est la première fois qu’un paramètre virologique est introduit dans le domaine de la potabilisation. Il doit être recherché dans la ressource et s’il est détecté, l’opérateur doit montrer son élimination en sortie de filière de traitement.

Dans le cadre de la REUT, ce sont les coliphages totaux qui sont recherchés, c’est-à-dire à la fois les coliphages somatiques et les bactériophages ARN F-spécifiques (Règlement UE 2020/741). Déjà demandé par l’arrêté du 2 août 2010, ce paramètre est désormais requis pour l’utilisation de l’eau destinée à l’irrigation de cultures vivrières consommées crues dont la partie comestible est en contact direct avec l’eau de récupération et les plantes sarclées consommées crues.

La recherche des coliphages somatiques et des bactériophages ARN F-spécifiques est utilisée pour évaluer l’efficacité de traitement des usines de potabilisation et des usines de traitement des eaux usées.

Pour en savoir plus sur les coliphages somatiques, consultez cet article.

Des indicateurs pour la lutte contre le covid-19

Dans le cadre de la lutte contre le SARS-CoV-2, l’ANSES a été saisie par le Ministère de la Transition écologique. L’agence doit évaluer deux virus, les bactériophages ARN F-spécifiques et les coliphages somatiques, pour suivre l’abattement du SARS-CoV-2 dans les eaux usées et les boues¹.

Les seuils retenus :
  Virus analysés Valeur seuil

Avant traitement

Valeur seuil

Après traitement

Eau potable Coliphages somatiques inf. à 50 PFU/ 100 ml 0 / 100 ml
REUT Coliphages totaux* 6 LOG d’abattement**

*Si l’analyse des coliphages totaux est impossible, au moins l’un d’entre eux (les coliphages F-spécifiques ou les coliphages somatiques) doit être analysé.
**Si les virus ne sont pas présents en quantité suffisante dans les eaux usées brutes pour parvenir à une réduction de 6 LOG, l’absence de cet indicateur dans l’eau traitée signifie que les exigences de validation sont satisfaites.

Les seuils établis par la réglementation imposent donc aux laboratoires d’analyses de disposer d’une méthode de concentration de l’échantillon.

Sur quelles normes s’appuyer pour l’analyse ? 

Les normes ISO 10705-1 et 10705-2 décrivent la méthode de détection des bactériophages ARN F-spécifiques et des coliphages somatiques respectivement. La détection se fait par comptage des plages de lyse sur gélose en double couche. Avec cette méthode, il est possible d’analyser jusqu’à 5 ml d’échantillon sur une même boîte. Ainsi, en inoculant 20 boîtes en parallèle, il est possible de détecter un virus dans 100 ml. Cependant, cette méthode est longue, fastidieuse, coûteuse en matériel et donc non adaptée à une analyse en routine.

La norme ISO 10705-3 propose donc plusieurs méthodes de concentration de ces virus, détaillées dans le tableau ci-dessous. Chaque laboratoire doit mettre en place et valider sa méthode selon les critères donnés dans la norme.

Les méthodes de concentration selon l’ISO 10705-3

Méthode Principe Les + Les – 
Adsorption/ élution 

Adsorption des virus sur un support via des interactions électrostatiques.

Elution dans 10-15 ml ou 500-1000 ml puis ultrafiltration pour reconcentrer.

Recommandé pour des échantillons de 10 à 100 litres.

  • Simple
  • Hauts rendements 
  • Investissement matériel élevé
  • Consommables chers
  • Colmatage
  • Faible reproductibilité
Floculation

Floculation des virus à l’aide de Mg(OH)2.

Elution dans 30 ml.

Recommandé pour des échantillons de 100 ml à 1 L avec une turbidité > 2 NTU.

  • Peu coûteux
  • Efficace pour les échantillons turbides
  • Temps de main d’oeuvre élevé
  • Utilisation de produits chimiques
  • Faible reproductibilité
Filtration sur membrane

Concentration des virus sur un support

Elution dans un volume < 5 ml.

Recommandé pour des échantillons de 100 ml à 1 L avec une turbidité < 2 NTU.

  • Temps de main d’oeuvre réduit
  • Simple
  • Reproductible
  • Rendements impactés par la vitesse de filtration
  • Peu de références de filtres disponibles

La filtration sur membrane est parfaitement adaptée à l’analyse de l’eau obtenue après traitement (REUT ou potabilisation). En effet, la concentration de 100 ml à 1 litre d’échantillon est suffisante pour atteindre les performances demandées. Par ailleurs, le traitement garantit généralement une bonne qualité d’eau avec un taux de matière en suspension et une turbidité faibles, rendant possible la filtration d’un litre d’eau sans problème de colmatage.

Ainsi, la filtration sur membrane s’avère être le meilleur compromis alliant simplicité, rapidité et performances.

La filtration sur membrane

Le principe repose sur la concentration de 100 ml à 1 litre d’échantillon d’eau sur une membrane spécifique ayant une affinité pour les virus recherchés. Ceux-ci sont ensuite élués dans une solution assurant la conservation de leur intégrité et de leur infectiosité. Le volume d’éluat (5 ml) ainsi que la membrane filtrante sont alors déposés en gélose double couche (10705-1 et -2) pour analyser l’intégralité de l’échantillon.

C’est ce que propose le kit VIRAPREP® , une méthode clé en main pour concentrer les coliphages somatiques et les bactériophages ARN F-spécifiques. Ce kit, qui répond intégralement aux exigences de la norme ISO 10705-3, permet de limiter l’analyse à l’ensemencement de deux ou trois boîtes.

Plusieurs laboratoires d’analyses ont obtenu l’accréditation COFRAC avec le VIRAPREP® comme méthode de concentration.

L’ATP-métrie : un indicateur prédictif des non-conformités bactériologiques des eaux

Les milieux HPC (Heterotrophic Plate Count) tels que le YEA, PCA ou R2A, couramment utilisés pour dénombrer les bactéries environnementales (ex : germes revivifiables à 22°C ou à 36°C), détectent moins de 1% de la flore totale (OMS, 2003). En effet, une large proportion des bactéries ne peut se multiplier sur ces milieux. C’est par exemple le cas des :

  • Bactéries anaérobies (stricts ou tolérants) : la présence d’oxygène ralentit ou inhibe leur croissance.
  • Bactéries nécessitant une température spécifique pour cultiver tels les psychrophiles (faible température) ou les thermophiles (hautes températures).
  • Germes nécessitant un environnement spécifique tel que les acidophiles (milieu très acide) ou les halophiles (haute salinité).
  • Germes ayant besoin d’éléments spécifiques comme des acides aminés rares, sucres complexes, vitamines, cations…
  • Bactéries incultivables dont la culture est impossible avec les techniques traditionnelles.

Représentation de la flore bactérienne totale

  • Bactéries VBNC (viables mais non cultivables) qui ont perdu leur cultivabilité de façon transitoire suite à un stress. L’utilisation de biocide, les traitements physiques (ex : UV) ou la modification des paramètres environnementaux (température, pH…) peuvent être à l’origine de cet état.

De plus, pour être détectée par l’œil du technicien, la bactérie doit être capable de former une colonie. C’est-à-dire passer d’une à plusieurs millions dans le temps de culture imparti. Cela implique une phase de latence courte et une vitesse de multiplication suffisamment rapide, paramètres dépendants notamment de la température d’incubation et du milieu utilisé.

En fin de compte, sur les milieux classiquement utilisés pour le contrôle des eaux, on ne détecte que la flore mésophile aérobie capable de cultiver entre 20°C et 45°C, dans le temps donné, et pour qui les éléments nutritifs du milieu sont adaptés.
Parler de « flore totale » par culture est une aberration !

Chaque milieu de culture en fonction des conditions choisies, ne va détecter qu’une fraction des bactéries.
Il faut donc parler de flore cultivable en indiquant le milieu de culture, la température et le temps d’incubation choisis.

Exemple de développement bactérien suivi par culture et par ATP-métrie

L’ATP-métrie, quant à elle, détecte l’ensemble de la flore bactérienne vivante en s’affranchissant du caractère cultivable. L’ATP-métrie permet ainsi de détecter les bactéries cultivables et non-cultivables. Pour ces différentes raisons, il est fréquent d’observer une augmentation de la flore totale par ATP-métrie bien avant l’apparition des colonies sur un milieu de culture.

L’ATP-métrie est un indicateur précoce d’une contamination microbiologique.

Comment évaluer l’efficacité d’un traitement UV par ATP-métrie ?

Le traitement UV

Principe de fonctionnement

La désinfection par UV est aujourd’hui régulièrement utilisée pour le traitement de l’eau potable. Les UV agissent sur les acides nucléiques (ADN/ARN) de la plupart des cellules (bactéries, virus, protozoaires…). Ils endommagent le matériel génétique des microorganismes les empêchant alors de se reproduire et/ou d’assurer une partie de leur fonction métabolique. On parle d’inactivation du microorganisme.

Suivant le type de microorganisme et de son état physiologique, l’inactivation aura un effet bactéricide entraînant la mort de la cellule, ou un effet bactériostatique qui entraîne un arrêt de la croissance de manière transitoire le temps que ce dernier répare son matériel génétique. Si l’UV est suffisamment puissant, il peut altérer l’intégrité membranaire entraînant la lyse immédiate de la cellule. 

Doses UV ou fluence

Cependant, les doses nécessaires varient d’un microorganisme à un autre. La dose UV ou “fluence” est le paramètre essentiel pour dimensionner une installation UV. Elle correspond au résultat de l’intensité d’émission de la lampe multipliée par le temps de contact, celui-ci étant directement dépendant du débit pour une installation hydraulique.

Le graphique ci-dessous représente l’efficacité de différentes puissances de réacteurs en fonction du débit de passage de l’eau. Les mesures sont effectuées 2h après le traitement grâce au kit d’ATP-métrie DENDRIDIAG® SW. Le graphique montre bien l’effet du débit sur la qualité du traitement UV. 

D’après la bibliographie, pour avoir une bonne efficacité sur l’ensemble des microorganismes, la dose UV doit être a minima de 40 mJ/cm². Généralement, les UV-C sont utilisés pour le traitement à une longueur d’onde de 254 nm.

Par ailleurs, plusieurs paramètres jouent sur l’efficacité du traitement UV :

  • la transmittance de l’eau,
  • la turbidité,
  • la teneur en matière organique,
  • la couleur,
  • l’encrassement des lampes (teneur en fer et en manganèse de l’eau, entartrage,… ),
  • l’épaisseur de la lame d’eau,
  • le vieillissement des lampes…

Contrairement à un traitement biocide tel que le chlore, l’UV n’a pas d’effet de rémanence. Si le matériel génétique est peu endommagé, les microorganismes ont la capacité de le réparer et peuvent alors se multiplier à nouveau. Il faut donc éviter de stocker une eau désinfectée aux UV au risque de voir l’apparition d’un développement bactérien important. Le traitement UV montre toute sa pertinence lorsqu’il est utilisé :

  • au point d’usage,
  • en complément d’autres traitements (potentialisation),
  • sur une eau très peu contaminée.

La mesure de l’efficacité du traitement UV par ATP-métrie

L’ATP-métrie quantitative mesure la quantité d’ATP présente dans les microorganismes. Il s’agit d’une mesure de la flore totale. 

Après une désinfection UV, on peut observer 3 scénarios par la mesure ATP :

  • Abattement immédiat : le réacteur UV détruit immédiatement les cellules qui libèrent leur ATP dans le milieu. L’étape de filtration sur membrane élimine alors l’ATP libre. 
  • Abattement observé 2h après le traitement : l’UV a efficacement endommagé les cellules mais n’a pas altéré leur intégrité membranaire. De ce fait, l’étape de filtration ne permet pas de les éliminer. Il est alors nécessaire d’attendre 2h que les cellules soient détruites pour observer l’effet bactéricide du traitement. 
  • Pas d’abattement observé 2h après traitement : l’UV n’a pas ou peu d’effet bactéricide. Il est alors important d’évaluer l’effet bactériostatique du réacteur. En effet, il y a un risque important de recroissance des bactéries. Si l’effet bactériostatique est démontrée, il est possible d’utiliser l’eau produite rapidement, sans étape de stockage.
Comment vérifier l’effet bactériostatique des UV ?

Suite à un traitement UV, prélever un litre d’eau traitée et effectuer une mesure d’ATP-métrie sur l’échantillon après 2h, puis toutes les 24h pendant 3 à 4 jours. Cette étude permettra d’observer l’évolution de la biomasse dans le temps comme le montre la figure ci-contre.

Attention, en culture, cet effet bactériostatique peut être confondu avec l’effet bactéricide. En effet, il entraîne une augmentation du temps de latence et donc une diminution ou une absence des GT22. 

Dans le cas où le traitement UV n’est pas satisfaisant, plusieurs options sont envisageables : 

  • augmenter la puissance de la lampe UV,
  • diminuer le débit de passage de l’eau, 
  • vérifier l’état des lampes ou l’encrassement des quartz, 
  • évaluer la transmittance de l’eau…

Schématisation de comportements de la biomasse après un traitement UV

Qui sont les coliphages, nouveau paramètre de la Directive Eau Potable ?

Les coliphages sont des virus capables d’infecter les bactéries coliformes comme Escherichia coli, ou plus rarement Shigella spp ou Klebsiella spp. E. coli est la bactérie la plus abondante dans l’intestin humain et animal. De ce fait, les coliphages, virus non pathogènes, sont également les plus abondants dans l’intestin.
Par ailleurs, il a été démontré que les coliphages ne se multiplient que très faiblement dans l’environnement car les conditions leurs sont trop défavorables. Ainsi, les coliphages retrouvés dans l’environnement proviennent principalement de contaminations d’origine fécale et peuvent être utilisés comme indicateurs de la qualité microbiologique de l’eau.

Caractéristiques principales des coliphages

Dans les eaux, on s’intéresse principalement à deux types de coliphages : les coliphages somatiques et les bactériophages ARN F-spécifiques. Ils se distinguent notamment par le récepteur bactérien auquel ils s’attachent pour l’infection.

Coliphage somatique Bactériophage ARN F-spécifique
Mode d’infection Infection par un récepteur de la paroi bactérienne. Infection par le pilus sexuel de la bactérie.
Taille Très variable (≈ 50-120 nm) 21-30 nm
Génome ADN simple ou double brin ARN simple brin
Familles les plus connues Myoviridae, Podoviridae ou encore Microviridae Leviviridae
Modèle le plus utilisé ϕX174 MS2

Le terme « coliphages totaux », que l’on peut retrouver dans certaines réglementations, regroupe les coliphages somatiques et les bactériophages ARN F-spécifiques.

Quel est le meilleur indicateur de contamination fécale/d’efficacité des traitements ?

Les coliphages somatiques sont-ils un meilleur indicateur de contamination fécale que les bactériophages ARN F-spécifiques ? Ceci est sujet à débat. Les études scientifiques semblent montrer que les coliphages somatiques sont généralement plus abondants dans les eaux que les bactériophages ARN F-spécifiques. Cependant, cela semble être l’inverse dans les eaux souterraines ou les eaux recyclées traitées aux UV. Par ailleurs, d’un point de vue purement méthodologique, la détection des coliphages somatiques est plus simple.

Ce qui est sûr, c’est qu’en comparaison avec les indicateurs bactériens, les coliphages sont moins sensibles aux procédés de désinfection et survivent plus longtemps dans l’environnement. Par ailleurs, les virus migrent plus rapidement et plus loin dans les sols que les bactéries. Ainsi, l’eau peut être contaminée par des virus entériques humains même en l’absence d’indicateurs bactériens traditionnels (bactéries coliformes/E. coli). Le rapport de l’ANSES (n° 2018-SA-0027), publié en 2018, souligne que les bactériophages sont de très bons indicateurs d’efficacité du traitement appliqué à l’encontre de virus.

Que demande la réglementation ?

Depuis quelques années, la réglementation introduit le suivi des coliphages pour contrôler la qualité d’eau aussi bien dans certains états des Etats-Unis ou d’Australie qu’en Europe. Ces nouveaux critères microbiologiques concernent l’eau destinée à la consommation humaine ainsi que les eaux usées traitées. Les réglementations existantes recommandent d’analyser soit la quantité de coliphages somatiques, soit de bactériophages ARN F-spécifiques, soit les deux.

En Europe, le dénombrement des coliphages somatiques est introduit dans la nouvelle Directive Européenne 2020/2184 « Eau potable » au niveau de la ressource. Si le résultat est supérieur à 50 PFU dans 100 ml, l’eau en sortie de filière de traitement doit être contrôle pour démontrer l’efficacité de traitement.

De plus, cette nouvelle directive introduit la mise en place des PGSSE. Ces plans de gestion demandent aux exploitants de mettre en place une stratégie générale de prévention des risques. Ainsi, il est pour eux indispensable de mettre en place de nouveaux indicateurs, comme les coliphages somatiques. Cette révision a été publiée le 23 décembre 2020.

On retrouve également le dénombrement des coliphages en Europe dans la réglementation européenne concernant la réutilisation des eaux usées traitées parue en juin 2020. Cette fois-ci, il est recommandé d’analyser les coliphages totaux en entrée et sortie de STEP. Un abattement de 6 LOG est par exemple demandé suivant la qualité d’eau destinée à l’irrigation agricole.

Comment les détecter  ?

Afin de répondre à ces nouvelles exigences réglementaires, les laboratoires doivent mettre en place les méthodes d’analyses adaptées. D’après le rapport de l’ANSES, en 2018 en France, seul un laboratoire était accrédité pour l’analyse des phages, et uniquement pour les bactériophages ARN F-spécifiques.

Les normes EN ISO 10705-1 et 10705-2 décrivent la détection par comptage des plages de lyse sur gélose en double couche pour les bactériophages ARN F-spécifiques et les coliphages somatiques respectivement.

Cependant, elles proposent uniquement de déposer 5 ml d’eau sur 20 géloses afin d’analyser les 100 ml d’échantillon. Cette méthode est longue, fastidieuse, couteuse en matériel et donc non adaptée à une analyse en routine.

Toutefois, la partie -3 de cette même norme conseille plusieurs solutions. D’après les études menées sur le sujet, la concentration sur membrane filtrante semble être la plus simple et la moins couteuse à mettre en place. Elle est particulièrement adaptée pour observer les abattement de 4 à 6 LOG demandés, pour l’analyse des eaux présentant une faible turbidité comme l’EDCH ou dans le cadre de la réutilisation des eaux usées traitées.

C’est pour cela que nous proposons le kit de concentration VIRAPREP® déjà utilisé par plusieurs laboratoires d’analyses.

Intégrer le risque microbiologique dans les PGSSE

La qualité de l’eau destinée à la consommation humaine (EDCH) est appréhendée au travers d’un ensemble de dispositions réglementaires régie par la Directive européenne « eau potable » 98/83/CE. 
Le projet de révision de cette directive prévoit une évolution vers des PGSSE (Plans de Gestion de la Sécurité Sanitaire des Eaux) obligatoires. Dès 2004, l’OMS a défini le cadre conceptuel des PGSSE. Il s’agit d’une approche globale visant à garantir en permanence la sécurité sanitaire de l’approvisionnement en eau potable.
Pour y parvenir, une stratégie générale de prévention et d’anticipation passant par une évaluation et une gestion préventive des risques doit être mise en place. C’est un changement de culture, avec le développement d’un savoir-faire mettant en avant l’anticipation, la proactivité et l’amélioration continue.

« Une approche anticipative plutôt que curative »

En résumé, le PGSSE doit permettre :

    • D’identifier les dangers et d’évaluer les risques sanitaires des installations de production et distribution d’eau potable ;
    • De déployer des moyens de terrain pour maîtriser ces risques ;
    • D’assurer l’efficacité des mesures en place et de contribuer à la préservation de la santé du consommateur.

Toutes les étapes de la production doivent être vérifiées depuis la ressource en eau, le captage, le traitement et la distribution jusqu’au robinet du consommateur.

Principales étapes d’un PGSSE

L’analyse des risques doit faire apparaître les défauts et dangers. C’est ensuite à l’exploitant de prioriser les actions en utilisant par exemple l’indice de criticité. Pour en savoir plus sur le sujet, consultez cet article.

Pour assurer le suivi des actions correctives et limiter la réapparition du défaut, il est indispensable de disposer d’outils de terrain. L’indicateur microbiologique doit :

    • être simple d’utilisation pour limiter le temps de mobilisation des hommes, 
    • donner un résultat immédiat, 
    • être peu onéreux
    • être représentatif de la biomasse totale (pathogène et non pathogène) .

En effet, les techniques de traitement utilisent des actions de filtration/oxydation qui éliminent toute la biomasse. Disposer d’un indicateur de flore totale est donc pertinent pour contrôler l’efficacité des traitements. Les méthodes culturales nécessitent un temps d’incubation de 18h à 24h a minima. Et cela sans compter les délais d’acheminement des échantillons au laboratoire, leur traitement et l’interprétation des résultats. De plus, ce délai augmente à 48h – 72h si l’échantillon est sous-traité à un laboratoire externe.

Quel outil utiliser pour valider en temps réel vos actions ?

L’ATPmétrie quantitative présente de nombreux avantages. En effet, elle donne en 2 minutes sur le terrain le niveau de charge microbiologique globale d’une eau. L’opérateur peut alors prescrire une action corrective immédiate s’il observe une dérive. Simple, rapide, utilisable par tous et donnant des résultats facilement intégrables, elle est complémentaire des analyses opérées en laboratoire agréé et des capteurs en place. Les résultats obtenus pourront alors alimenter les modèles existants en données qualifiées et fiables.

L’ATP-métrie donne un résultat en picogramme d’ATP pouvant être converti en équivalent bactéries selon une convention. Pour faciliter l’interprétation, nous proposons des seuils de surveillance et de contrôle. Ces limites ont été établies à partir des retours clients et d’une étude comparative effectuée en partenariat avec le CNR-IRSA et SMAT en 2018. 

 

Seuils établis pour la surveillance de l’eau potable :

Une nouvelle app !

Pour rendre l’ATP-métrie plus conviviale et pertinente, GL Biocontrol développe une nouvelle app. Elle combine les résultats d’analyse des paramètres physico-chimiques et microbiologiques pour donner une interprétation globale sur la qualité d’eau. Cette application servira d’aide à la prise de décision. Ce travail s’effectue dans le cadre de l’appel à projet READYNOV soutenu par la Région Occitanie.

Après désinfection ou en sortie de filière

Réseau de distribution d’eau potable

L’indicateur microbiologique permet de : 

  • Vérifier les pratiques et les réalités d’intervention des personnels d’opération (délégataire, fonctionnaire territorial, prestataire externe) ; 
  • Apprécier l’efficacité des bonnes pratiques métiers : purge, réparation sur branchement ou canalisation, désinfection/sanitation, suivi du fonctionnement du réseau d’eau potable via les capteurs/modèles (hypervision, autres dispositifs…) ;  
  • Améliorer la réactivité des personnels d’interventions, en cas de situations d’urgence (contamination accidentelle bactériologique et/ou chimique, suivi des alarmes critiques, …) ;
  • Lever le doute sur une pollution potentielle, une pollution accidentelle, une intrusion réservoir, un prélèvement sur hydrant…
  • Enrichir le panel d’outils et conforter les organisations.

Grâce à cet outil, les exploitants des réseaux (fermage, collectivités et régies) pourront intervenir sur des problématiques très variées :

  • Mise ou remise en service des ouvrages après une désinfection,
  • Mise en service des canalisations neuves ou après travaux,
  • Gestion de crise lors de la contamination du réseau,
  • Contrôle des eaux de rinçage pendant la désinfection (citerne de camion, eau du réseau…)
  • Suivi de non-conformités,
  • Analyse suite à une réclamation client,
  • Le suivi d’un programme « eau sans Chlore »,
  • L’optimisation des purges d’antenne,
  • L’identification d’anomalies suite à un changement climatique (inondation, orages …), 
  • Etc…

Qu’est-ce qui va changer avec la nouvelle Directive européenne Eau Potable ?

L’arrêté du 11 janvier 2007 dépendant de la directive 98/83/CE définissait jusqu’à aujourd’hui la qualité de l’eau utilisée pour la production d’eau destinée à la consommation humaine. La Commission européenne a proposé une évolution de la directive sur l’eau potable qui a été publiée fin 2020.

La révision apporte des modifications sur la nature des paramètres à contrôler et sur leurs valeurs limites. Cet article traite uniquement des paramètres microbiologiques. La nouvelle directive amène également un changement complet de paradigme avec l’introduction des PGSSE (Plans de Gestion de Sécurité Sanitaire de l’Eau).

Paramètres microbiologiques

Les paramètres donnés représentent les minimas imposés par la nouvelle Directive Européenne. Les Etats Membres sont ensuite libres d’ajouter des paramètres ou des limites de qualité plus stringentes.

Références et limites de qualité de l’arrêté du 11 janvier 2007 et de la nouvelle directive 2020/2184

PARAMÈTRES Seuil limite

Arrêté 11 janvier 2007

Seuil limite

Directive 2020/2184

Remarques
Escherichia coli (E. coli) 0 UFC/100 ml 0 UFC/100 ml Limite de qualité
Entérocoques 0 UFC/100 ml 0 UFC/100 ml Limite de qualité
Bactéries coliformes 0 UFC/100 ml 0 UFC/100 ml Référence de qualité
Bactéries sulfito réductrices y compris les spores 0 UFC/100 ml X Référence de qualité
Clostridium perfringens X 0 UFC/100 ml Uniquement si l’analyse des risques le préconise.
Germes aérobies revivifiables à 22°C Variation dans un rapport de 10 par rapport à la valeur habituelle. Pas de changement significatif. Référence de qualité
Germes aérobies revivifiables à 37°C. Variation dans un rapport de 10 par rapport à la valeur habituelle. X Référence de qualité
Coliphages somatiques X < 50 PFU/100 ml Référence de qualité

Dans la ressource. Si dépassement, contrôle de l’eau en sortie de traitement.

Legionella X < 1000 UFC/L Référence de qualité

Seulement dans les réseaux de distribution intérieurs.

 

Paramètres fondamentaux

E. coli et les entérocoques sont considérés comme des paramètres fondamentaux et doivent obligatoirement être contrôlés a minima aux fréquences définies par l’annexe II.B. La fréquence de contrôle dépend essentiellement du volume de production d’eau potable.

Bactéries coliformes 

Les bactéries coliformes sont présentes naturellement dans les sols, la végétation et l’intestin des mammifères. Généralement non pathogènes, ces bactéries sont des indicateurs de contamination fécale. Il n’y a pas de changement sur ce paramètre.

Bactéries sulfito-réductrices et Clostridium perfringens

La recherche de bactéries sulfito-réductrices au sens large est remplacée par la recherche de Clostridium perfringens. Cette bactérie, naturellement présente dans les fèces, est beaucoup plus résistante qu’E. coli. En effet, dans sa forme sporulée, elle survit plus longtemps que les coliformes et peut résister à l’action des agents biocides. Une présence de Clostridium perfringens montre notamment un dysfonctionnement du système de filtration.

Germes totaux à 22°C et 37°C

La référence de qualité concernant le dénombrement des germes aérobies revivifiables à 37°C a été supprimée de la directive. Seule est maintenue la numération des germes totaux à 22°C à 72h. Un regard plus critique de l’évaluation de ce paramètre est demandé car il s’agira maintenant de regarder s’il n’y a pas de changement anormal de ce paramètre au cours du temps.

Coliphages somatiques

La nouvelle directive introduit le suivi des coliphages somatiques comme marqueur de contamination fécale. Jusqu’à présent, aucun paramètre virologique n’était présent. Un rapport de l’ANSES, publié en 2018, décrit notamment les coliphages somatiques comme un excellent indicateur pour évaluer l’efficacité d’un traitement contre les virus. Les coliphages somatiques sont des bactériophages capables d’infecter certaines souches-hôtes d’Escherichia coli, bactérie la plus présente dans la flore intestinale des mammifères.

Son contrôle représente une avancée sanitaire importante pour une distribution et une consommation d’eau de bonne qualité. En effet, l’eau peut être contaminée par des virus entériques humains alors que les indicateurs bactériens actuels sont négatifs. Par ailleurs, il a été démontré que ces virus sont moins sensibles aux traitements de potabilisation.

La recherche des coliphages somatiques sera obligatoire au niveau de la ressource avec une limite fixée à 50 PFU/100 ml. Si cette valeur seuil est dépassée, un contrôle devra être effectué après la filière de traitement pour évaluer son efficacité.

Legionella spp.

Un nouveau paramètre bactériologique fait son apparition : Legionella spp. Cette espèce de bactérie, pourtant très surveillée dans les réseaux d’eau chaude sanitaire n’était jusqu’à maintenant pas recherchée dans l’eau potable. Afin de mieux gérer le risque lié aux légionelles tout en limitant les coûts pour les exploitants d’eau potable, la Commission Européenne a décidé d’instaurer ce paramètre uniquement pour les réseaux de distribution intérieurs.

 

Le PGSSE (Plan de Gestion de Sécurité Sanitaire de l’Eau)

La Directive européenne 2015/1787 avait déjà introduit le principe des PGSSE sans les rendre obligatoires. La nouvelle Directive européenne 2020/2184 « Eau potable » amène une évolution pour les rendre obligatoires à moyen terme.

Il s’agit d’une approche globale visant à garantir en permanence la sécurité sanitaire de l’approvisionnement en eau potable. Pour y parvenir, une stratégie de prévention et d’anticipation des risques doit être mise en place. C’est un changement de paradigme, avec le développement d’un savoir-faire mettant en avant l’anticipation, la proactivité et l’amélioration continue.

Le PGSSE couvre toutes les étapes de l’approvisionnement en eau, du captage jusqu’au robinet du consommateur. Par ailleurs, toutes les unités de production d’eau potable doivent mettre en place ces analyses des risques.

JOURNÉE TECHNIQUE
MISE EN PLACE D’UN PGSSE
Une journée technique gratuite sur la mise en place d’un PGSSE se tiendra le mardi 29 septembre à Montpellier et le mardi 13 octobre à Amiens.
Sabine Lapouge (SAS COPE), experte dans le domaine sécurité sanitaire de l’eau potable, animera cette journée.

S’INSCRIRE

Les 3 phases de la démarche PGSSE

Basée initialement sur les 11 modules de l’OMS, la démarche de mise en place d’un PGSSE repose avant tout sur la constitution d’une équipe pluridisciplinaire dédiée au PGSSE pour sa mise en œuvre. Cette approche peut également être résumée en trois phases, comme présenté dans le webinaire tenu en mai dernier :

La première phase permet d’appréhender le système et de construire une analyse fonctionnelle de l’installation de production et distribution d’eau potable. Cette étape aboutira à la réalisation d’un plan d’échantillonnage et à un premier schéma directeur d’amélioration.

La deuxième phase correspond à la mise en place de l’analyse des dangers pour l’évaluation des risques. Celle-ci mettra en évidence les défauts qui pourraient avoir un impact défavorable sur la qualité de l’EDCH. La gravité du défaut sera évaluée en fonction des résultats des indicateurs mis en place. Pour prioriser les actions, on pourra par exemple utiliser l’indice de criticité défini ci-dessous :

 IC (indice de criticité) = G (gravité) × F (fréquence) x D (détection)

Enfin, la troisième étape consiste à définir les actions correctives à mettre en place ainsi que les indicateurs de suivi. Ces marqueurs microbiologiques permettront de lever les doutes sur une défaillance du réseau, valider l’efficacité et la pertinence des actions correctives et contrôler les opérations de maintenance.

La nécessité des contrôles de terrain

Dans ce contexte, il est nécessaire de disposer d’outils de terrain donnant des résultats rapides. Au niveau microbiologique, les techniques de traitement utilisées sont basées sur des actions de filtration/oxydation qui éliminent toute la biomasse. Disposer d’un indicateur de flore totale (pathogène et non pathogène) est donc pertinent pour contrôler l’efficacité des traitements dans le temps et dans l’espace. L’ATPmétrie quantitative, avec son résultat obtenu en 2 min, présente de nombreux avantages. En effet, elle permet de contrôler sur le terrain le niveau de la charge microbiologique globale d’une eau et de prescrire une action corrective si une dérive est observée. L’utilisation d’un tel indicateur permet de diminuer l’indice de criticité.

Les délais pour mettre en place ces analyses des risques et définir les nouveaux paramètres à suivre sont détaillés dans le tableau suivant. Si l’analyse des risques met en évidence que certains paramètres ne sont pas nécessaires, ils pourront être écartés. Seul le dénombrement des E. coli et des entérocoques doit obligatoirement être réalisé.

Délai de mise en place de la démarche PGSSE après l’entrée en vigueur de la Directive Européenne 2020/2184 et délai de renouvellement.

Délai de mise en place Renouvellement
Ressource 4 ans et demi Tous les 6 ans
Réseau de distribution  6 ans Tous les 6 ans
Réseau de distribution intérieur 6 ans Tous les 6 ans

Webinaire – Gestion microbiologique de l’EDCH : l’ATP-métrie, un indicateur d’aide à la décision

La révision de la directive européenne 98/83/CE relative à la qualité de l’eau destinée à la consommation humaine (EDCH) prévoie de rendre les PGSSE obligatoires.

Les PGSSE (Plans de Gestion de la Sécurité Sanitaire des Eaux) constituent une démarche d’amélioration continue ayant pour but de garantir en permanence une qualité microbiologique optimale. Il s’agit d’une stratégie globale visant à identifier les dangers liés à l’exploitation des systèmes de production et de distribution d’eau. Le but étant de prévenir les risques sanitaires en mettant en œuvre un plan d’actions adapté. Pour suivre les actions menés, il est indispensable de disposer de marqueurs de terrain donnant des résultats immédiats.

Au travers de ce webinaire, nous vous présentons :

  • L’ATP-métrie, outil d’autocontrôle dans un PGSSE,
  • Le principe de l’ATP-métrie DENDRIDIAG®,
  • Les performances de cet outil analytique,
  • Toutes les applications terrain pour le contrôle de l’EDCH,
  • Réponses à vos questions…

Pour aller plus loin, découvrez notre série d’articles concernant l’analyse microbiologique de l’EDCH :

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Comment évaluer l’efficacité d’un traitement UV par ATP-métrie ?

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Le traitement UV Principe de fonctionnement La désinfection par UV est aujourd’hui régulièrement utilisée pour le traitement de l’eau potable. Les UV agissent sur les acides nucléiques (ADN/ARN) de la…

Retours de chantier, non conformités… Comment utiliser l’autocontrôle pour les éviter ?

Après une intervention sur le réseau (nettoyage de réservoirs, mise en service de canalisation, gestion de crise…), il est indispensable de contrôler la qualité microbiologique de l’eau. Les analyses réglementaires reposent sur la méthode culturale et ne donnent un résultat définitif que 3 jours plus tard. Souvent, il est difficile d’attendre ce résultat pour remettre en service le réseau. L’incidence d’une non conformité entraîne alors un retour de chantier, un risque sanitaire pour les usagers, une dégradation de l’image, voire des pénalités financières.

Pour limiter au maximum ces problèmes, il est nécessaire de mettre en place un outil d’autocontrôle. De plus, ce dernier est en passe de devenir obligatoire avec l’arrivée des PGSSE. Les techniques de traitement utilisées pour la gestion du réseau d’eau potable sont basées sur des actions de filtration/oxydation qui éliminent toute la biomasse. Disposer d’un indicateur de flore totale (pathogène et non pathogène) est donc pertinent pour contrôler l’efficacité de ces traitements dans le temps et dans l’espace. 

Cet indicateur doit aussi être simple, rapide, utilisable par tous. Il doit donner des résultats facilement intégrables, complémentaires aux analyses conventionnelles opérées en laboratoire agréé et aux capteurs en place (sur sites et/ou réseaux). Aujourd’hui, des autocontrôles par culture existent et présentent une bonne ergonomie mais nécessitent un temps d’incubation d’au minimum 18h, ce qui empêche toute réactivité. 

L’ATPmétrie quantitative présente de nombreux avantages. En effet, elle donne en 2 minutes sur le terrain le niveau de charge microbiologique globale d’une eau. Ainsi, l’opérateur peut prescrire une action corrective immédiate si une dérive est observée.

Cas d’étude d’une maintenance menant à une non conformité

Comparaison avec et sans autocontrôle - Remise en service après intervention
Avec autocontrôle donnant un résultat immédiat

Après l’intervention, l’opérateur effectue une analyse sur le terrain de la qualité microbiologique de l’eau. L’analyse révèle un niveau de biomasse élevé annonçant une probable non conformité des analyses réglementaires. L’opérateur réagit alors immédiatement et réalise une nouvelle procédure de nettoyage et désinfection. L’installation est ainsi sécurisée et les retours de chantier évités. Le second contrôle par ATP-métrie montre que l’installation est sous contrôle microbiologique, il peut attendre les résultats réglementaires de façon sereine.

Sans autocontrôle

L’opérateur réalise le prélèvement bactériologique mais ne peut remettre en service l’installation sans risque. Il obtient le premier résultat au plus tôt 2 jours après l’intervention. Pendant ce lapse de temps, si l’installation a été remise en service, l’eau consommée est potentiellement dangereuse. Lorsque le résultat est non conforme, il faut organiser un retour chantier suivi d’un nouveau cycle d’analyse repoussant encore d’au moins 48h la remise en service sans risque.

« Le PGSSE impose de déployer des moyens de terrain, dont les indicateurs microbiologiques pour maîtriser les risques. »

Des utilisations très variées

L’outil d’autocontrôle se montre pertinent dans de très nombreux cas, comme par exemple : 

  • Remise en service des ouvrages après une désinfection (réservoirs, usine de production…),
  • Mise en service de canalisations neuves ou après travaux,
  • Gestion de crise lors de la contamination du réseau,
  • Contrôle des eaux de rinçage pendant la désinfection (citerne, eau du réseau…),
  • Plaintes clients sur la qualité de l’eau, 
  • Enquête suite à une non conformité, 
  • Arrêts prolongés de la distribution ou production…

Comment réaliser un prélèvement d’EDCH pour une analyse microbiologique ?

Le prélèvement d’eau constitue la première étape pour assurer une analyse bactériologique réussie et fiable. Il conditionne les résultats et l’interprétation qui en sera donnée. L’échantillon doit être représentatif de l’eau du réseau à un instant donné. Pour cela, il est nécessaire de respecter plusieurs étapes clés.

 

La description des étapes ci-dessous s’appuie sur les recommandations COFRAC.

Attention ! Le flambage ne doit être effectué que si le matériau est compatible. Si la désinfection du point de prélèvement n’est pas possible, il est indispensable d’effectuer une purge d’au moins 1 minute avant de réaliser le prélèvement.

 

Quel flacon utiliser ?

Pour réaliser une analyse bactériologique, il est indispensable d’utiliser un flacon de prélèvement stérile. Dans le cas d’un réseau d’eau chloré ou utilisant des agents oxydants pour la désinfection du réseau, on distingue deux cas :

  •       Vous réalisez l’analyse immédiatement après le prélèvement :

Le prélèvement peut être réalisé dans n’importe quel type de flacon stérile. Dans le kit d’ATP-métrie DENDRIDIAG, nous fournissons des pots de prélèvement stériles.

  •       Vous réalisez l’analyse plus d’une heure après le prélèvement :

Si vous réalisez une campagne de prélèvement et analysez les échantillons qu’ultérieurement, le prélèvement doit se faire dans un flacon stérile contenant du thiosulfate de sodium. Ce contenant ne doit jamais être rincé au préalable. Le thiosulfate de sodium neutralise l’action des biocides oxydants, c’est-à-dire qu’il stoppe leur effet désinfectant. Ainsi l’échantillon d’eau reste représentatif du réseau avec sa charge microbiologique au moment du prélèvement. La conservation et le transport de l’échantillon doit être réfrigéré et ne pas dépasser 18h.

Si vous utilisez une désinfection UV, il est conseillé de laisser le prélèvement se stabiliser 2h avant de l’analyser pour voir l’effet optimal.

Si vous souhaitez comparer l’ATP-métrie à d’autres méthodes d’analyses, le prélèvement doit être réalisé dans le même type de flacon et dans les mêmes conditions. Il sera ensuite divisé entre les différentes analyses. Pour en savoir plus à ce sujet, consultez cet article